La microscopie confocale multi photonique des échantillons biologiques permet l'analyse tridimensionnelle non destructive de ces échantillons. Cette technique est particulièrement intéressante pour l'analyse des échantillons élastiques : peau, cartilage, muscle et ligament.

Microscope confocal multiphoton

Le microscope confocal multiphoton retenu est un composé d'un microscope droit FN1^® et d'un confocal multiphotons A1R MP PLUS^®.

Objectifs

Les recherches poursuivies au sein de l'Équipement d'Excellence IVTV sont focalisées sur l'effet du vieillissement sur la réponse mécanique en relation avec la microstructure 3D des tissus élastiques. On entend par microstructure la distribution du réseau de fibres de collagène et de fibres élastiques (1 µm).

Le microscope confocal multi-photons a pour objectif d'observer la microstructure 3D de la peau, du cartilage, du muscle et du ligament sous sollicitation mécanique. Cet appareil permet de mettre en oeuvre des techniques d'imagerie non-invasives et des systèmes d'analyse d'images associés permettant des représentations tridimensionnelles précises ainsi que des analyses qualitatives et quantitatives à l'échelle micrométrique.

Observation du collagène en SHG (violet) et de l'élastine (vert) par autofluorescence sur de la peau de porc (300 µm × 300 µm)	Observation du collagène en SHG sur os ostéoporotique (500 µm × 500 µm)

Ces techniques d'imagerie peuvent être couplées à des systèmes de sollicitations mécaniques in situ dans le microscope confocal.

Localisation

Il est installé au sous-sol du Bâtiment G8 de l'Ecole Centrale de Lyon.

Caractéristiques techniques

Le microscope confocal multi-photons possède les fonctionnalités suivantes :

• Le microscope droit à platine fixe FN1^® est équipé d'un axe Z motorisé d'une précision de 100 nm.
  

• Le microscope est équipé d'un objectif 25X, NA 1.1, immersion à eau avec une distance de travail de 2 mm. Cet objectif fait partie de la gamme λS de Nikon, qui bénéficie de la technologie «nanocristal coat» uniquement développée par Nikon pour réduire les réflexions et obtenir une sensibilité extrême. cet objectif 25X est spécialiement dédié à l'imagerie confocale et multi-photons, avec un niveau de correction et transmission optimisé de l'UV à l'IR.

• Accès à l'imagerie en profondeur avec une détection non descannée à haute sensibilité :

• Le nouveau système de détection NDD (détecteurs non déscannés) de type GaAsP à 4 canaux développé par Nikon permet d'observer les échantillons sur des profondeurs records. Un détecteur doté d'une sensibilité très élevée et d'une zone sensible plus étendue que les modèles conventionnels est placé à proximité de la pupille arrière de l'objectif, à l'endroit où se forment les images. Cette configuration assure une efficacité optimum de la détection du signal avec un rapport signal-bruit plus élevé et moins d'aberrations. Les signaux provenant des niveaux très profonds de l’échantillon peuvent ainsi être détectés.

• Acquisition et séparation rapide d'images spectrales à 32 canaux :

• Le système est équipé d'un détecteur spectral haute sensibilité. Celui-ci permet l'exécution d'une imagerie spectrale rapide jusqu'à 16 images/s (512 x 64 pixels). De plus, celui-ci permet une séparation spectrale en temps réel, lors de l'acquisition des images. Ainsi, une image de 512 x 512 pixels et 32 canaux de fluorescence peut être séparée en moins d'une seconde.

• Le scanner résonnant permet d'atteindre une vitesse d'imagerie de 420 images/s :
• Le scanner résonnant permet l'imagerie d'une large zone à une vitesse nettement supérieure aux autres scanners, 30 images/sec en 512 x 512 pixels et jusqu'à 420 images/s en 512 x 32 pixels. Le système d'horloge optique du pixel mis au point par Nikon permet une imagerie en mode résonnant précise et stable avec un éclairage plus régulier, même à vitesse élevée.
   
• Alignement du faisceau laser multiphoton automatique :

• Lorsque l'on modifie la longueur d'onde du laser infra rouge, la position de visée du faisceau se décale, ce qui a pour effet une perte de l'efficacité du système multiphotons. Le système est équipé d'une fonction d'alignement automatique du laser permettant de corriger les défauts d'alignement du laser multiphoton. Ceci est la garantie d'une reproductibilité et d'une qualité constante des expériences.

• Les caractéristiques techniques du microscope confocal multiphoton Nikon A1R MP PLUS^® sont détaillées dans le document ci-joint.
• Le logiciel NIS (Nikon Imaging System) permet l'acquisition, la visualisation et la reconstruction 3D.

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